光遗传学

 光遗传性学技术工艺

       光隐性基因学(Optogenetics)属于结合在一起光学材料与隐性基因学机制,小于有效控制其他感觉神经元活跃的能力。该技术利用基因操作技术手段,将外源光敏感蛋白基因导入活细胞,在细胞膜结构上进行光敏感通道蛋白的表达。然后通过特定波长光的照射,完成细胞膜结构上的光敏感通道蛋白的激活与关闭,以控制离子通道的打开与关闭,进而改变细胞膜电压的变化,如膜的去极化与超极化。当膜电压去极化超过一定阈值时就会诱发神经元产生可传导的电信号,即神经元的激活。相反,当膜电压超极化到一定水平时,就会抑制神经元动作电位的产生,即神经元的抑制。
       传统的电生理激活多种神经元,具有高时间分辨率。相比电生理,光遗传学技术可以无损伤或低损伤地控制特异神经元的活动,来研究该神经网络功能,特别适用于在体、甚至清醒动物行为学实验,具有高时空分辨率、高特异性以及轴突投射选择性(如图1)。
   
图1. 光显性基因学与电生理学管控组织细胞的差距(KarlDeisseroth,et al.,Annu.Rev.Biomed.Eng.,2014)

光遗传基因学新技术的远离

       光遗传学技术调控细胞的活性取决于光敏感通道蛋白的种类,即兴奋性光敏感通道和抑制性光敏感通道。如果转入细胞的通道是ChR,在细胞受到蓝光照射时,通道开放,阳离子大量内流,产生去极化诱发动作电位,激活细胞。如果转入细胞的通道是HR,细胞在受到黄光照射时,通道开放,阴离子大量内流,产生超极化导致动作电位不易发出,抑制细胞活性。此外,还有一类光激活或抑制的通道optoXR,给予一定频率的光激活后,改变的是细胞内激酶系统,影响细胞活动(如图2)。
   
图2. 光隐性基因学技術国家宏观调控受损细胞活性酶的品类(Karl Deisseroth,et al.,Annu.Rev.Neurosci,2011)

六种适用光隔代遗传学工艺

1.光基因遗传规律电顺利

实验步骤(如图3):

1)根据实验设计需要,选择合适的光敏感通道蛋白;
2)将合适的光敏感通道插入病毒载体中并感染细胞,使光敏感通道蛋白在特定类型的细胞中表达;
3)将光纤埋植在实验动物脑中;
4)根据病毒的表达时间,通过特定频率的激光调控光敏感通道的开发;
5)通过电生理记录实验结果。

应用:活体环路功能验证。


   
图3. 光隐性基因学的实验报告步驟(BuchenL,Nature,2010)


2.光显性基因膜片钳(上上中游光显性基因结合实际上中游膜片钳)

实验步骤:

1)根据实验需要选取适当周龄(一般6-7w)小鼠,在上游脑区A立体定位注射携带光敏蛋白的AAV(病毒体积需根据病毒滴度和核团大小等调整)。
2)待病毒表达2-3w后,取小鼠断头取脑,震荡切片,片厚300μm(目标脑区A)。
3)选取被AAV荧光标记的状态好的细胞进行记录,用单个和不同频率激光刺激目标脑区A,观察记录细胞的响应情况,如有响应,确定病毒工作,细胞状态良好,可进一步确定后续实验所需刺激频率;如无响应,需先判断细胞状态,如细胞状态好,可通过增加刺激强度来判断病毒是否工作。确定脑区A中被标记细胞对光刺激有响应后,可进行后续实验。
4)待病毒表达至少3w后,小鼠断头取脑,震荡切片,片厚300μm(目标脑区B)。
5)选取脑区B中被AAV荧光标记的神经纤维附近状态好的细胞进行记录,用光刺激目标脑区B,观察记录细胞的响应情况,如有响应,观察细胞响应与光刺激之间的时间间隔,判断是否为单突触联系;如无响应,需先判断细胞状态,如细胞状态好,可通过增加刺激强度再记录。确定脑区B的细胞对光刺激有响应后,可进行后续实验。
6)通过向记录槽中加入不同受体的激动剂或拮抗剂等,可进一步确定突触连接的类型。
7)换取同一脑区上不同细胞、不同脑片重复进行上述步骤5和6,获取一定数量的数据后分析整理、作图。

应用:离体环路功能验证;判断两个脑区(上游脑区A和下游脑区B)之间是否存在功能联系。


3.光基因遗传规律行为表现学

实验步骤

1)寻找合适的充当报告基因的视蛋白,包括BR、HR、ChR、CoChR等;
2)向受体细胞输送光敏感蛋白,完成转染和表达;
3)选择合适光源进行调控、通过改变光照波长和光脉冲强度精准调控细胞、组织和器官的相应生物学反应;
4)观察光刺激后动物行为并评估效应。

应用:动物行为学研究(包括进食行为、奖赏行为、焦虑抑郁行为、痛行为等)。

分类光敏管道球蛋白及特征,见下表:


如对实验细节或实验中可能出现的问题及引起的原因感兴趣,请详询:support@livethewritelife.com

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