钙成像与光纤记录

钙阴离子影像技术性

       钙亚铁铝阴阳离子三维成像的技术(Calciumimaging)是采取钙亚铁铝阴阳离子提示剂在线检测组织性内钙亚铁铝阴阳离子浓度值的方案。钙离子成像技术主要用于神经系统研究中,其中钙离子变化提示神经元活动。这项技术广泛应用于神经生物学,细胞生物学,生理学,发育生物学和药物学领域中。其中,神经生物学中主要研究神经细胞离子浓度改变引发的信号发射,生理学中主要研究肌肉运动-心肌细胞中的钙信号,细胞生物学中主要研究信号传导和离子通道,发育生物学中主要研究卵受精机制,药物学中主要用于筛选药物、药效学考察等方面。

钙化合物显像系统的作用

       钙离子成像技术属于光遗传学技术中的一类,实际检测的是细胞或组织中Ca2+的浓度变化,将钙浓度变化转化为荧光信号,从而使细胞电活动转化为可记录的光信号。检测的手段是利用可以感应Ca2+的浓度的钙离子指示剂完成的。钙离子指示剂分为两种,一种为化学性钙离子指示剂(chemical calcium indicators),另一种为现在普遍使用的遗传编码钙离子指示剂(genetically-encoded calcium indicators,GECIs),例如GCaMP。GCaMP由绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、钙调蛋白(calmodulin, CaM)和肌球蛋白轻链激酶的一段肽段序列M13构成。当有Ca2+结合CaM时,CaM发生构象变化,其轻链区可以结合M13,在特定波长的光照下GFP发色团的质子化作用增强、吸光度增加,从而使GFP发出强烈的荧光。如图1所示。
   
图1. GCaMP结构的及目的构造图(来自于维基百度百科)

三个最常见胃中钙手机信号记下手段

1. 钙阳离子电信光纤记录好(Fiber Photometry)

        钙离子光纤记录是基于钙离子浓度变化的荧光成像,实时检查和记录细胞活性变化。这种技术的出现对于编码社交行为、学习记忆和恐惧等行为以及病理状态下的回路水平神经信号的探测具有里程碑式的意义。

优势:

1)可以实现细胞类型特异性的活性检测;
2)具有较强的抗干扰性能;
3)易实现长时程的活性监测。

劣势:

不能用于记录单个神经元的活性。


光纤记录实验步骤:

1)向实验动物大脑特定脑区注射一定量的GCaMP病毒。
2)在注射GCaMP病毒相同的位置植入一根直径200-400μm的光纤陶瓷插芯,用于传送激发光和收集发射光。
3)光纤记录系统,原理上可以分为荧光激发系统和荧光收集系统。
       激发光经过光纤跳线和动物头部陶瓷插芯后到达特定脑区,从而激发绿色荧光信号。被激发的荧光信号的强度可以被植入动物脑内的光纤末端收集,收集到的荧光经传感器转换为电信号,随后经数据采集卡被传送至记录系统,以达到实时观察所研究脑区一群神经细胞钙荧光活动的目的。
4)数据分析。
       通常将荧光信号根据行为划分成不同的小段,并使其按照特定的行为事件为时间零点对应整齐。我们用当前荧光强度F和基线荧光强度F0的差值再除以基线荧光强度F0的值即ΔF/F0=(F−F0)/F0的值来表征事件周围的荧光强度变化。分析的结果常用两种图表征,即热度图(heat map)和事件相关的线图(peri-event plot)。

2. 双光量子活体钙影像

       利用双光子成像技术,在给予活体刺激时,记录被GFP标记到的神经细胞的光变化来判断神经细胞活动。该方法适用于选择大脑表面层作为研究区域。

优势:

1)在双光子显微镜中,激发光波长在700-1000nm附近,接近红外光谱。这是体内双光子成像的第一个优势。长波长的光在组织中的散射更少,穿透深度更大。
2)具有良好的分辨率,不仅允许单个神经元可视化,而且可以看到亚细胞结构轴突末端的钙活动。

劣势:

1)可能发生的光漂白。区分信号和噪声的激发光强度通常需要足够高,会引起一定程度的漂白,光漂白超时会对图像质量产生负面影响。
2)在成像深度方面受许多因素制约。可以植入微型内窥镜 [梯度折射率(GRIN)的透镜] 使更深部的脑区可视化,但是由于物镜的大小,大部分皮层或其他脑区结构经常需要被完全移除来为透镜植入留出空间,这样可能会严重影响动物的行为。
3)动物头部需要固定。人们认为,头部固定的动物在实验期间一直处在物理约束和情绪压力下,因此无法证明该环境下神经元对外界的响应和自由探索下是等价的。更重要的是,许多社会行为,比如亲子护理,交配和战斗,都不能用头部固定的实验来研究。


双光子活体钙成像实验步骤:

1)第一次手术,暴露硬脑膜并进行微量AAV注射(50-100nL,滴度约10^13);
2)放归动物回笼进行恢复,并服用抗生素一周;
3)45-60天后进行二次手术,在前额和后脑勺分别植入头柱,并用T形钢架链接这些头柱;
4)再次打开硬脑膜以暴露皮质,将玻璃盖片、硅酮胶、钛环和GORE膜组成的窗单元推到皮质表面,将GORE膜插入硬脑膜下,粘合钛环和颅骨形成成像腔;
5)执行行为任务或刺激,二次手术恢复约10天后使用双光子显微镜进行双光子成像。


3. 单光波小型空气开关体视显微镜活体钙三维成像

优势:

1)基于微型显微镜的单光子活体钙成像,研究人员可以记录自由活动动物的钙信号。
2)通过与梯度折射率(GRIN)的透镜连接,可完成长时间内群体神经元活动的观察。
3)装置体积小,可以固定在动物头上,不会严重阻碍其运动。这项技术的发展使得微型显微镜成为研究发育、神经可塑性和神经退化性疾病的一种非常有用的工具。

劣势:

1)与双光子相比,单光子成像背景荧光更高,并且更容易发生光散射。
2)在某些行为学实验在应用受限,比如水迷宫和强迫游泳实验。
3)由于GRIN透镜植入物的直径范围为0.5mm~1mm,不可避免地会造成一定范围的组织损伤,这可能会影响研究的关键回路。

较为常用基因遗传规律打码钙铝离子指令剂(GECIs),见下表:


如对实验细节或实验中可能出现的问题及引起的原因感兴趣,请详询:support@livethewritelife.com

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